Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System-6141

Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)은 Cap 구조와 Poly(A) 서열을 가진 mRNA를 간편하게 고효율로 합성할 수 있는 키트로, 아래의 두 제품으로 구성되어 있다.

Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
- in vitro transcription (IVT)에 사용되는 plasmid template을 간편하게 제작
Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)
- 최적화된 in vitro transcription (IVT) 시스템으로 고품질의 Capping 된 mRNA를 고수율로 합성

※이 제품에는 Cap analog가 포함되어 있지 않습니다.

본 제품은 CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)에 최적화되어 있으며, CleanCap® Reagent AG는 별도로 준비 바랍니다.

그림 1. Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141) workflow

Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
mRNA의 IVT용 template을 cloning하기 위한 선형화된 plasmid와 편리한 cloning을 위한 In-Fusion® 시약 및 control fragment (FLuc)가 포함되어 있다. 선형화된 plasmid에는 T7 promoter, transcription start sequence (AGG), 5’-UTR (untranslated region), 3’-UTR, Poly(A) 서열 (105 염기)이 포함되어 있다. 여기에 발현하고자 하는 유전자 (coding sequence: CDS)를 cloning하여 mRNA 합성용 plasmid template을 제작할 수 있고, 합성된 mRNA는 인간이나 쥐와 같은 포유류 세포에 적용 가능하다
* Linearized Template Vector의 서열 정보는 링크를 참고해 주세요.
Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)
T7 promoter 서열을 포함한 dsDNA를 template으로 IVT 반응을 통해 mRNA를 합성하기 위한 제품이다. 본 제품은 IVT 반응 후 template DNA를 제거하기 위한 DNase I과 합성된 mRNA를 정제하기 위한 LiCl 용액을 포함하고 있다. 진핵생물에서 mRNA를 protein으로 translation 하기 위해서는 5’ 말단에 Cap 구조를 필요로 한다. 본 키트는 CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)를 이용한 Cap 구조를 가진 mRNA합성에 최적화 되어 있다. 또한 세포 도입 시 면역원성을 최소화하기 위해 UTP 대신 pseudo UTP를 사용하는 경우에도 mRNA의 수율 감소 없이 IVT를 진행할 수 있다.

본 제품을 사용하면 1회 반응 당 (20 ㎕) 최대 200 ㎍ 이상의 RNA 합성이 가능하다. 또한 필요 시 scale up이 가능하며, 200 ㎕ 반응에서도 mRNA 수율의 직선성 (수율 기대치)에 문제가 없음을 확인했다 (사용자 메뉴얼 참고).

Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)을 사용해 mRNA를 합성하는 경우 목적 유전자 (GOI) cloning 후 Poly(A) 서열 하류에 추가 서열 없이 제한효소로 절단하는 것이 중요하다. 따라서 mRNA 합성용 plasmid의 선형화에는 Hind III (Code 1060A)의 사용을 강력히 권장한다 (사용자 메뉴얼 참고).

내용

Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)

Linearized Template Vector (50 ng/㎕)	10 ㎕
FLuc Control Fragment (100 ng/㎕)*1	10 ㎕
5× In-Fusion Snap Assembly Master Mix	20 ㎕

*1 FLuc Control Fragment의 서열 정보는 아래를 참고.

Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)

10× Transcription Buffer	40 ㎕
10× ATP	40 ㎕
10× CTP	40 ㎕
10× GTP	40 ㎕
10× UTP	40 ㎕
10× Enzyme Mix	40 ㎕
Nuclease-Free Water	3 x 1 ㎖
DNase I	80 ㎕
Lithium Chloride Precipitation Solution	600 ㎕
Positive Control Template (FLuc) (0.5 ㎍/㎕) *2	10 ㎕

*2 T7 promoter, 5’-UTR, FLuc CDS, 3’-UTR, Poly(A) 로 구성, 상세한 서열 정보는 아래를 참고.

내용

Template DNA나 반응에 사용되는 tube, micro-pipette 등이 RNase에 오염되어 있는 경우 RNA의 수율이 저하되거나 fragmentation이 일어날 수 있습니다. 따라서 RNase free의 전용 tube 및 micro-pipette을 사용하고 일회용 장갑을 사용하여 RNase 오염을 주의 바랍니다.
10x Enzyme Mix는 과도한 vortexing을 피하시기 바랍니다.
Lithium Chloride Precipitation Solution은 사용 전에 실온에서 융해 바랍니다. 융해 후 혼합한 이후에도 침전물이 남을 경우 37℃에서 용해시키고, 그래도 침전물이 남는 경우에는 그대로 사용해도 됩니다.